регионы России
Направления деятельностиО нас455-ФЗУслугиФилиалыПресс-центрКонтакты
Карта филиалов
Российского центра защиты леса
Посмотреть филиалы списком
закрыть

Общая информация

Телефон единой диспетчерской службы
Федерального агентства лесного хозяйства

8-800-100-94-00

 

 

Лесная генетика

Проведение ДНК-анализа

в лабораториях лесной генетики ФБУ «Рослесозащита» в 2015 году

 

Правила отбора образцов (кроме воды): 

-         масса образца (хвои, листьев, древесины) не менее  1 г, сеянцы целиком с корневой системой; 

-         каждый образец должен быть помещен в отдельный бумажный пакет;

-         доставка образцов:  в срок до 24 часов с момента отбора может осуществляться в свежем виде, более  24 часов  - только в подсушенном до воздушно-сухого состояния, возможна отправка по почте;

-         листья и хвою можно отбирать целыми, древесину – в виде опилок (сверлом на глубину до 1 см), кернов или спилов (отбор образца древесины со спила или керна производится на границе здоровой и больной ткани).

 

C:\Users\smi_iev\Pictures\новости\Центральный офис\Новая папка\32.jpg

C:\Users\smi_iev\Pictures\новости\Центральный офис\Новая папка\33.jpg

 

Примечания:

 

* Срок исполнения заказа:

– 3 дня (при выборке до 50 образцов), каждые следующие 50 образцов + 1 день.

 

 Выезд специалистов для отбора образцов (если необходимо) – в зависимости от удаленности объекта:

до 30 км - 1500 руб.,

от 30 до 50 км – 2500 руб.,

от 50 до 100 км – 3500 руб., далее – по согласованию.

Перед самостоятельным отбором образцов необходимо проконсультироваться со специалистом.

 

** Стоимость анализа:

-         при подозрении на корневую губку, опенок, ризину волнистую, разные виды трутовиков (до рода) – 400 руб.,

-         заболевания растений неясной этиологии  (определение до вида) – 1000 руб.

 

 

 

 

Контакты:

 

Пушкино – (495) 993-34-07, Шишкина Ольга Карловна, начальник Отдела лесной генетики; shok3011@yandex.ru

Воронеж -  (473) 235-71-45, 235-77-11, Сиволапов Владимир Алексеевич, начальник Отдела лесной генетики; vladimir-sivolapov@ya.ru

Красноярск – (391) 249-41-72, 290-71-55, Шилкина Елена Алексеевна, начальник Отдела лесной генетики; helenbeauty74@mail.ru

Барнаул – (3852) 63-68-20, Кальченко Людмила Ивановна, начальник Отдела лесной генетики, altay-lss@yandex.ru

 

 

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ ДНК АНАЛИЗА

ДЛЯ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМ ЛЕСНОГО ХОЗЯЙСТВА

 

1. Определение видового состава фитопатогенов в лесных питомниках

 

В ряде регионов России масштабы гибели посадочного материала в лесных питомниках в результате повреждения различными заболеваниями являются неприемлемыми для современного производства. Одна из причин этого – имеющиеся проблемы при определении возбудителей болезней.

 

Внешние признаки заболеваний сеянцев и саженцев часто очень схожи (табл. 1). При внешнем осмотре больных растений не всегда удается поставить правильный диагноз.

 

Таблица 1Сеянцы сосны обыкновенной,

пораженные различными инфекциями: внешний вид растений,

название болезни, возбудитель

 

 

однолетки

 

Кладоспориоз Cladosporium sp.

 

IMG_1053

 

Альтернариоз Alternaria alternate

 

 

Елецкие

 

Бурое шютте Rhizosphaera kalkhoffii

 

 

IMG_1017

 

Склерофомоз Sydowia polyspora

 

4

 

Фомоз  Phoma sp.(macrostoma, pomorum)

 

Наибольшую степень развития данное заболевание приобретает в дождливые сезоны или в периоды излишней увлажненности почвы. Массовое распространение возбудителей фомоза обычно отмечается весной - спорами.

 

Фомоз – инфекционное заболевание сельскохозяйственных и лесных видов растений, вызываемое сумчатыми грибами рода Phoma.  

 

Спектр поражаемых лесных древесных видов включает значительное количество хвойных и лиственных растений.

 

Грибы рода Phoma способны поражать различные органы пихты, ели, сосны, лиственницы, псевдотсуги, клена, ясеня, ореха, березы и некоторых других древесных пород.

 

Наибольшая вредоносность фомоза наблюдается при развитии их на молодых растениях, в том числе сеянцах и саженцах в питомниках.

 

Грибы в виде спор могут долгое время (в течение нескольких лет) сохранять свою жизнеспособность в верхних слоях почвы или подстилке.

 

 

Можно видеть, что внешними проявлениями различных видов основных болезней посадочного материала в лесных питомниках чаще всего являются пожелтение и усыхание хвои. Это часто приводит ошибочной постановке диагноза заболевания при визуальной оценке сеянцев и саженцев даже специалистами с опытом работы.

 

Однако, для успешной борьбы с заболеванием необходимо определение возбудителя - до вида. Только в этом случае можно рассчитывать на то, что результаты применения препаратов для борьбы с ними будут эффективным. Эти препараты должны применяться избирательно – различные для различных возбудителей болезней.  В противном случае (без четкого понимания для борьбы с каким возбудителем применяется препарат) результаты обработки посевов  (растений) могут быть нулевыми. Более того, будет упущено время для принятия мер по борьбе, что приведет к полной гибели посадочного материала. Кроме того, средства, затраченные на приобретение препаратов и осуществление работ по обработке растений, будут выброшены «на ветер» в прямом и переносном смысле.

 

При этом методы лесной генетики для  выявления фитопатогенов в лесных питомниках очень производительны, и сокращают сроки постановки точного диагноза от нескольких недель до нескольких дней (табл. 2). Кроме того, вид  патогена может быть определен на самой ранней стадии развития инфекции, когда внешние признаки заболевания еще никак не проявляются, а меры борьбы наиболее эффективны.

 

Таблица 2 – Сравнительный анализ традиционных и молекулярно-генетических методов определения фитопатогенов

 

Традиционные методы

ДНК - анализ

 

-         Срок – 2-3 недели

-         Влажная камера или посев на искусственные питательные среды

-         Микроскопирование – может не быть спороношения, т.е. определение невозможно

-         На искусственных питательных средах – может наблюдаться рост сопутствующей микро-флоры. Соответственно, определение вида патогена может быть ошибочным

-         Точность определения до вида – низкая.

-         Количественное определение – крайне сложно

 

-         Срок – 2-3 дня

-         Выделение и анализ ДНК

-         Точность определения до вида -100%.

-         Количественное определение – 2 дня

-         Определение доминантного патогена, вызывающего заболевание, независимо от стадии его развития

-         Ранняя диагностика

 

 

Сравнительный анализ частоты встречаемости основных заболеваний сеянцев в питомниках Европейской части РФ и Западной Сибири приведены на рисунке 1. Из представленных результатов видно, что альтернариозы и кладоспориозы  в Западной Сибири встречаются гораздо реже, нежели в Европейской части, тогда как фомозы, наоборот, там  значительно более часты. 

 

Рисунок 1 - Сравнительный анализ частоты встречаемости заболеваний сеянцев

в питомниках Европейской части РФ и Западной Сибири

 

Ранее считалось, что гибель сеянцев вызывают, в основном, виды рода  Fusarium  (фузариозы). Однако результаты обследования учеными Института леса НАН РБ лесных питомников в Республике Беларусь с применением ДНК-анализа показали, что  на самом деле гибель сеянцев происходит, главным образом,  в результате их поражения различными видами патогенных грибов рода Phoma  (фомозы).

 

По результатам генетических исследований установлено, что и в лесных питомниках Российской Федерации основной болезнью сеянцев 2-го года жизни также являются фомозы, а не фузариозы. Причина ошибок при определении  видов патогенов традиционными методами заключается, по-видимому, в том, что грибы рода Fusarium, в отличие от рода Phoma, легко культивируются на искусственных питательных средах,  тогда как выращивание и выделение в чистую культуру видов Phoma sp. сопряжено с определенными трудностями.

 

Таким образом, применение методов ДНК анализа позволит  успешно применять меры борьбы с точно выявленными видами болезней на самых ранних стадиях развития последних, когда эти меры являются наиболее эффективными.

 

2. Выявление заболеваний в насаждениях

 

Наибольший ущерб лесным насаждениям наносят инфекционные заболевания. При этом среди всех фитопатогенов около 97% составляют грибные инфекции, 2% - бактериальные и 1% — вирусные. При этом препараты, предназначенные для борьбы с грибными инфекциями, могут не действовать на бактерии и вирусы и наоборот.

 

Традиционный фитопатологический анализ основан на изучении имеющихся явных симптомов проявления болезней: гнилей, пятнистости листьев, опухолей, некрозов и др. Однако эти симптомы могут проявляться уже на поздних стадиях развития болезней. Данный подход не позволяет проводить раннюю диагностику, при том, что наблюдения могут носить длительный характер, а диагноз будет, в значительной степени, субъективным (основанным на опыте исследователя),  поскольку сходные внешние симптомы заболеваний (также как и при заболеваниях сеянцев, саженцев) могут быть вызваны различными видами патогенных организмов.

 

 C:\Users\gen_sho\Desktop\14.09.2011 Электрогорск\Фото0211.jpg

Кроме того, существуют виды патогенов, о которых большинство лесоводов не знает. В частности,  Ризина волнистая (Rhizina undulata Fr.) вызывает  массовую гибель растений  хвойных пород течение первых 3-х лет после посадки на площадях, пройденных пожарами, если лесовосстановление проведено на первый – второй год после пожара.   

       Плодовые тела Ризины волнистой.

Данная болезнь вызывает корневую гниль и особенно сильно поражает молодые растения после посадки - их гибель иногда доходит до 100%. Характерная черта этой болезни – стремительное развитие. Она внезапно появляется,   в   течение    нескольких    лет (обычно 5 – 6) нарастает, вызывая массовое усыхание растений, а потом медленно утихает. После лесных пожаров Ризина волнистая  развивается в больших количествах, особенно на песчаных почвах и в хорошо освещенных местах.

 

В качестве примера. На территории в Московской области с применением методов лесной генетики  было обследовано 674 га площадей, пройденных пожарами 2010 года.   Выявлено, что Rhizina undulata Fr. встречается, в зависимости от участков наблюдений, на 50- 85% их площадей.

 

Воронежская область: главное - не навредить лесам.

Один из наиболее распространенных патогенов в лесных насаждениях, наносящий им огромный ущерб, – корневая губка (Henerobasidion annozum (Fr) Breff 1889). 

 

Заболевание протекает скрытно, заражение растений происходит уже на стадии саженцев, а распад древостоя начинается в возрасте 30-40 лет.

 

За период 2010-2014 гг. методами лесной генетики  в Московской области обследовано 1700 га площадей, подготовленных для посадки лесных культур, на наличие генетического материла  корневой   губки.  Установлено, что патоген встречается на 85% площадей обследованных лесных участков.  Выборочное определение степени зараженности насаждений сосны обыкновенной  было проведено в 10 лесничествах Алтайского края. В 3-х из них было выявлена высокая степень скрытого поражения насаждений корневой губкой, без проявления каких-либо внешних признаков

 

Таким образом,  применение метода анализа ДНК патогенов для оценки фитопатологического состояния лесов  имеет чрезвычайно важное значение.  Как и для посадочного материала, наличие или отсутствие патогена (грибы, бактерии, вирусы) может быть определено по анализу его ДНК без выделения   в чистую культуру, что позволяет сократить сроки исследования (по сравнению  с традиционными методами - несколько недель) до 2-3-х дней.

 

Инфицирование насаждения может быть выявлено на самой ранней стадии, когда внешне оно ещё никак не проявляется. Это дает возможность применять меры борьбы с инфекциями в ранние сроки - тогда, когда они будут наиболее эффективны.

 

 

 

Таблица 3  – Сравнительный анализ методов диагностики болезней посадочного материала

 

Критерий

Метод диагностики

Морфологи-ческий

(визуальный)

Микробиологи-ческий

Имуно-ферментный

Биохими-ческий

Молекулярно-генетический

- ДНК-анализ

Диагностируемая стадия патогенеза

поздняя

средняя

ранняя

средняя

ранняя

Срок выполнения

5-10 минут

10-15 суток

2-3 часа

5-10 минут

2-5 часов

Себестоимость проведения анализа 1 образца  ($США)

-//-

25-30$

1-5

10-15

8-25 у.е.

Точность определения болезни

низкая

высокая

средняя

средняя

высокая

Наличие специализирован-ного оборудования

не требуется

необходимо

наличие

необходимо

наличие

не требуется

необходимо

наличие

Таксономический ранг определения инфекции

нет

род, вид

род

семейство, род

вид, штамм

Количество диагности-руемых заболеваний (разработанных методик)

15-20

не ограничен

30-40

10-15

не ограничен

Используемые диагностические критерии

симптомы поражения растений

Морфологические и физиологические

признаки патогена

антигены патогена

вторичные метаболиты патогена

генетический материал патогена

Возможность автоматизации анализа

нет

нет

да

нет

да

Общая эффективность диагностики

низкая

средняя

высокая

средняя

высокая

 

В силу скорости и высокой производительности (таблица 3) метод анализа ДНК патогенов предоставляет возможность массового обследования лесных насаждений с целью оценки их фитопатологического состояния.  

 

3. Установление принадлежности партии семян селекционной

категории (нормальные или улучшенные)

 

Установление принадлежности семян лесных растений селекционной категории – улучшенные (заготовленные на лесосеменной плантации - ЛСП) или нормальные (заготовленые в насаждении или ПЛСУ) весьма важно в случаях, когда у потребителя (заказчика) возникают сомнения в достоверности данных о происхождении и селекционной ценности партий семян лесных растений, указанных в документах об их качестве.

 

Уникальная, не имеющая аналогов в мировой практике, разработка ФБУ «Рослесозащита» (2014 год) позволяет достоверно устанавливать, заготовлена партия семян сосны или ели в насаждении или на ЛСП. Суть методики – на основе ДНК-анализа – установление, какое количество материнских линий (митотипов) присутствует в партии семян. На ЛСП их количество, как правило, соответствует количеству представленных плюсовых деревьев. В насаждении количество материнских линий не велико – 2-3 (рис. 2).

 

Рисунок 2. Количество митотипов сосны обыкновенной в естественном насаждении (слева) и ЛСП (справа)

 

Данный вид работ наиболее методически сложен.  Однако однажды выполненная работа по установлению «генетических портретов» ЛСП в каком-либо регионе,  будет позволять в последующем вести эффективный контроль за действиями недобросовестных производителей и пресекать возможные попытки выдать за улучшенные обычные семена, заготовленные, в т.ч. насаждениях низкой продуктивности и качества.

4. Установление фактического размещения клонов плюсовых деревьев в объектах лесного семеноводства

 

 

IMG_0018

Наращивание производства семян лесных растений селекционной категории «улучшенные», обеспечивающих повышение продуктивности и качества лесов не менее чем на 10% (в соответствии с мировой практикой)  возможно при условии увеличения площадей аттестованных лесосеменных плантаций (ЛСП). При этом аттестации подлежат ЛСП, размещение клонов в которых соответствует схеме, предусмотренной рабочим проектом согласно ОСТ 56-74-96

 

Однако создание ЛСП – методически сложный и длительный процесс (заготовка черенков с плюсовых деревьев, их прививка на подвои, выращивание привитых саженцев, их высадка на подготовленной площади в соответствии со схемой). При выполнении этих работ, как  показывает практика, происходят ошибки - путаница в нумерации клонов и даже использование вегетативного материала, не принадлежащего плюсовым деревьям.

 

Для выявления таких ошибок существуют различные методики, основанные на различиях в форме шишек, цвете и фактуре семян, форме крылаток и пр., присущих плюсовым деревьям и их вегетативному потомству. Однако ни одна из этих методик не может дать 100% точного результата.

 

Единственным  методом, позволяющим получить такой (гарантированно точный) результат является метод - анализ ДНК плюсовых деревьев и их потомства, представленного на ЛСП. При этом объектами исследований  служат образцы хвои или древесины.

 

На рисунке слева показана схема одной из ЛСП в Московской области 80-годов создания, на которой (по результатам ДНК-анализа) показаны: красным цветом привитые растения, не являющиеся потомством плюсовых деревьев, желтым цветом – привитые растения, являющиеся потомством плюсовых деревьев, но размещенные с нарушением схемы смешения клонов.

5. Установление расы непарного шелкопряда в Сибири

 

Определение расы непарного шелкопряда, одного из наиболее опасных насекомых - вредителей лесных насаждений, имеет очень большое практическое значение. В России в настоящее время встречаются  2 расы непарного шелкопряда – европейская и азиатская. Азиатская раса отнесена к карантинному виду вредителей леса.  Ограничения лесохозяйственной деятельности, налагаемые карантинной службой в случае появления в стране азиатской расы, повлекут значительный экономический ущерб соответствующему региону.

 

 

Контроль над непарным шёлкопрядом становится более эффективным в соотношении цена-качество

 

Однако все методы, используемые в настоящее время для определения расы непарного шелкопряда, очень субъективны и продолжительны (не менее месяца). Основное различие между расами – хорошо летающие (азиатская раса) и плохо летающие (европейская раса) самки.  Один  из наименее субъективных из применяемых  критериев – так называемый «флай-тест» -способность только что вылупившейся из кокона самки, будучи положенной на спинку, перевернуться (азиатская раса) или не перевернуться (европейская раса).

 

Найдены и генетические различия между расами – мутация митохондриального гена, отвечающего за синтез фермента цитохром-С-оксидазы. Исследования наличия корреляции между наличием мутации и «флай-тестом» не проводились. Это обстоятельство вызывает сомнения у энтомологов о возможности применения генетических методов для определения расы непарного шелкопряда.

 

Однако, очевидно, что именно метод лесной генетики – ДНК–анализ дает возможность абсолютно достоверно определить наличие мутации за 2 дня, тогда как «флай-тест» занимает не менее 3-х недель, если исследуются коконы, если исследуются яйцекладки – не менее 3-х месяцев. Кроме того, генетический метод очень производителен, позволяет в короткое время проводить массовые анализы, образцы могут храниться сухом виде долго и могут пересылаться по почте.

 

Исходя из вышеизложенного существуют основания для осуществления (в регионах, в которых существует угроза появления азиатской расы непарного шелкопряда) мониторинга ситуации с применением методов ДНК анализа, также работ исследовательского характера для установления зависимости результатов генетических исследований и «флай-теста».

Корпоративный вход