регионы России
Направления деятельностиО нас455-ФЗУслугиФилиалыПресс-центрКонтакты
Карта филиалов
Российского центра защиты леса
Посмотреть филиалы списком
закрыть

Общая информация

Телефон единой диспетчерской службы
Федерального агентства лесного хозяйства

8-800-100-94-00

 

 

Молекулярно-генетическая диагностика грибных болезней в лесных питомниках

Молекулярно-генетическая диагностика грибных болезней в лесных питомниках

Баранов О.Ю., к.б.н., ведущий научный сотрудник ГНУ «Институт леса НАН Беларуси»
Ярмолович В.А., к.б.н., доцент БГТУ
Пантелеев С.В., магистр, аспирант ГНУ «Институт леса НАН Беларуси»
Купреенко Д.Г., инженер ГНУ «Институт леса НАН Беларуси»
 
Введение
Одной из основных проблем, связанных с выращиванием посадочного материала в лесных питомниках являются инфекционные болезни растений, вызываемые различными патогенными микроорганизмами: грибами, реже бактериями и вирусами. Зачастую воз-никновение и развитие заболеваний связано с первичным ослаблением и снижением устойчивости сеянцев и саженцев, вследствие длительного неблагоприятного воздействия метеорологических факторов (засуха, заморозки и др.) или нарушения агротехники выращивания. Также немаловажным является и использования зараженных семян или почвенных субстратов [1]. 
Мероприятия по защите сеянцев и саженцев древесных пород от болезней представ-ляют собой целый комплекс агротехнических, биологических, химических, физико-механических и других методов. При этом лесопатологическому мониторингу и профилактическим мероприятиям отводится ключевая роль, что связано, в первую очередь, с экономической целесообразностью предупреждения развития болезней по сравнению с органи-зацией и проведением мероприятий по оздоровлению посадочного материала [2].
Основой фитопатологического анализа в полевых условиях является макроскопиче-ский метод – диагностика болезней по внешним признакам ослабления/повреждения рас-тений на основе прямой визуальной оценки. По состоянию и анатомо-морфологическим изменениям растений, особенностям проявления симптомов часто удаётся определить только тип болезни (шютте, ржавчину или пятнистость листьев, инфекционное полегание сеянцев, корневую гниль и др.), без установления точных причин ее вызвавших и иденти-фикации возбудителя заболевания. Для более достоверной диагностики заболеваний выполняют микроскопирование пораженных тканей с целью обнаружения патогенного микроорганизма и его идентификации по структуре мицелия и плодовых тел, особенностям спороношения. Микроскопический метод является наиболее распространенным в практике специализированных лабораторий лесозащитных организаций. В случае затруднения прямой микроскопической диагностики болезней данный метод дополняют микологическим – пересевом фитопатогенных организмов из растительных тканей на специальные искусственные питательные среды – создание культур изолятов in vitro. Недостатками исследования фитопатогенов путем пересева инфекционного начала в чистую культуру являются длительность исследований, их трудоемкость и отсутствие специфических сред для каждого конкретного вида возбудителя болезни. Следует также отметить, что некоторые виды облигатных паразитов не способны произрастать в искусственных условиях или требуют для роста многокомпонентные селективные среды, сложные в приготовлении. Кроме того, некоторые грибные организмы в культуре могут терять стадию полового процесса, что де-лает данные культуры непригодными для видовой идентификации. Особые требования предъявляются также к уровню квалификации персонала, проводящих культивирование и определение микроорганизмов [3].
На текущий момент наиболее современными и перспективными способами диагностики и видовой идентификации болезнетворных микроорганизмов являются методы, ос-нованные на применении технологий молекулярной генетики. Общие принципы диагностики возбудителей инфекционных заболеваний сводятся к выявлению генетического материала патогена в тканях хозяина или образцах почвы, воды, воздуха, соскобах, пыли и др. с помощью специфических реактивов и оборудования [4].
В настоящее время на диагностическом рынке имеется большое количество наборов, предназначенных в основном для генетической идентификации инфекционных болезней человека и сельскохозяйственных животных. Коммерческие наборы для анализа возбудителей болезней растений представлены в меньшей степени, и их основной перечень ориентирован на выявление патогенов сельскохозяйственных культур. В тоже время диагностические исследования заболеваний лесных древесных видов зачастую проводятся только специализированными лабораториями научно-исследовательских и образовательных учреждений на основе разработанных оригинальных или представленных в литературе ме-тодик.
На базе лаборатории генетики и биотехнологии Института леса НАН Беларуси разработана технология ранней диагностики возбудителей грибных и бактериальных заболева-ний лесных древесных видов. В рамках Государственной научно-технической программы «Леса Беларуси – продуктивность, устойчивость, эффективное использование» проводится фитопатологическое обследование лесных питомников на основании использования методов ДНК-маркирования и внедрение технологии ранней диагностики и идентификации бо-лезней древесных растений в лесохозяйственную практику.
Целью данной работы явилась молекулярно-генетическая диагностика и установление видового состава фитопатогенных грибов, вызывающих болезни посадочного материала в лесных питомниках.
 
Материалы и методы
Экспериментальный материал для анализа был непосредственно собран в лесных питомниках или предоставлен лесопатологической службой лесхозов Гомельского, Минско-го, Могилевского, Гродненского и Брестского ГПЛХО. Для фитопатологической диагностики были отобраны фрагменты вегетативных органов одно-трехлетнего посадочного материала восьми древесных пород (сосны, ели, лиственницы, пихты, туи, дуба, клена, липы, березы) с признаками инфекционного поражения. Общее число образцов составило 630 шт. Образцы фиксировались в 70% спирте и хранились при -20°С. Дополнительный экспериментальный материал был представлен 60 образцами почвы.
Процедура молекулярно фитопатологической диагностики состояла из следующих стадий, представленных на рисунке 1: выделение суммарной ДНК из инфицированных растений, амплификация локусов грибной ДНК методом ПЦР, расшифровка структуры амплифицированных локусов (секвенирование), сравнительный анализ в базе данных (идентификация).
Рисунок 1 – Схема проведения молекулярно-генетической диагностики патогенов в лесном посадочном материале
 
Выделение суммарной ДНК из растительного материала, растительных остатков было выполнено CTAB-методом, почвы – PEG-методом [5]. Для установления видовой принад-лежности изолятов была проведена амплификация и секвенирование региона рДНК, вклю-чающего следующую последовательность локусов: 18S рРНК – ВТС1 – 5,8S рРНК – ВТС2 – 28S рРНК. ПЦР-анализ был выполнен на основании использовании DreamTaq™ Green PCR Master Mix (Fermentas, Литва) при следующих параметрах реакции: начальная денатурация 5 мин. при 95ºC, последующие 35 циклов 20 сек. при 95 ºC, 25 секунд при 67 ºC, и 45 секунд при 72 ºC, и финальная элонгация 8 мин при 72ºC. Для амплификации были ис-пользованы праймеры ITS1 и ITS4 [6]. Предварительный анализ продуктов амплификации был выполнен с помощью электрофоретического фракционирования в 2,5% агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием, а также дополнительным рестрикционным анализом [5]. Альтернативные по размеру и рестрикционным спектрам (MspI, AluI, TaqI, RsaI, HhaI) ампликоны отобраны для последующего секвенирования. Секвенирующая реакция была выполнена на основании  использования набора BigDye Terminator Sequence Kit v.1.1 (Applied Biosystems, США) согласно протокола компании-изготовителя. Электрофоретическое фракционирование проведено с помощью генетического анализато-ра ABI Prism 310 (Applied Biosystems, США), интерпретация результатов – программного обеспечения Sequence Analysis 5.1.1 (Applied Biosystems, США). Для установления (под-тверждения) видовой принадлежности образцов, нуклеотидная структура секвенированных ампликонов была проанализирована с помощью программы BLAST в GenBank NCBI [7].
 
Результаты и их обсуждение
В ходе проведенной молекулярно-генетической диагностики посадочного материала в инфицированных растениях было выявлено наличие генетического материала патогенов. В случае электрофоретического анализа ПЦР-продуктов, образцы инфицированных растений хвойных пород на фореграммах были представлены окрашенными зонами – выявляемый генетический материал патогенных микромицетов, в тоже время здоровые растения характеризовались отсутствием ДНК возбудителей заболеваний (рисунок 2) [8]. При использовании технологии ПЦР в реальном времени у зараженных растений в ходе прохож-дения программы амплификации наблюдалось накопление ПЦР-продукта (наличие S-образной кинетической кривой), у здоровых образцов график амплификации являлся гори-зонтальным, а уровень сигнала находился в пределах уровня детекции фоновых значений (рисунок 2) [5].
 
 
М – электрофоретический стандарт, 1, 5, 6, 8, 9 – здоровые растения, 2-4, 7, 10-16 – инфи-цированные растения
 
Рисунок 2 – Молекулярно-фитопатологическая диагностика посадочного материала хвойных методами классической ПЦР (слева) и ПЦР в реальном времени (справа)
 
ДНК-спектры посадочного материала лиственных пород (дуба, клена, липы, березы) кроме генетического материала патогена, в случае инфицированных растений, содержали и ампликоны растения-хозяина, что связано с гомологией регионов генов 18S и 28S рРНК грибов и покрытосеменных растений (рисунок 3) [9]. Здоровые сеянцы и саженцы характе-ризовались наличием только одной окрашенной зоны, специфичной для исследуемой по-роды. Данная диагностическая особенность лиственных пород использовалась в качестве дополнительного внутреннего контроля протекания ПЦР-реакции. Отсутствие фракции растения-хозяина в ПЦР-спектре указывало на нарушение технологии молекулярно-фитопатологического анализа. 
Следует также отметить, что расположение фракций на электрофореграмме зависело от размера выявляемого фрагмента ДНК патогена, и являлось величиной видоспецифичной. Данный признак использовался в качестве первичного критерия при проведении идентификации возбудителя заболевания [10].
 
 
М – электрофоретический стандарт, 1, 2, 4-7, 9 – здоровые растения, 3, 8 – инфицированные растения
 
Рисунок 3 – Молекулярно-фитопатологическая диагностика посадочного материала лиственных пород
 
В ходе обследования лесных питомников для большинства образцов инфицирован-ных растительных тканей были получены многофракционные ПЦР-спектры, что свидетельствовало о содержании генетического материала более чем одного вида патогенов. Несмотря на многофракционный тип выявляемых спектров, наибольшей интенсивностью обычно характеризовался какой-либо один или несколько доминирующих альтернативных вариантов ампликонов, что указывало на большее количественное содержания соответствующего ему вида гриба в исследуемом образце (рисунок 4) [11].
 
 
Рисунок 4 – ПЦР-спектр патогенов саженцев ели европейской (Быховский лесхоз)
 
На основании проведенного изучения 630 образцов пораженных растений и 60 образ-цов почвы из питомников лесхозов было выявлено 44 наиболее распространенных вариан-тов ампликонов. Проведенное секвенирование и последующий анализ данных нуклеотид-ных последовательностей в Генном Банке NCBI позволил идентифицировать 44 различных вида грибов, относящихся к 23 родам отдела Ascomycota. Следует отметить, что спектр бо-лезней, выявленных у лиственных пород, являлся типичным для условий Беларуси и был представлен: черной пятнистостью листьев клена (возбудитель Rhytisma acerinum), церко-спорозом липы (возбудитель Cercospora microsora), мучнистой росой березы (возбудитель Microsphaera betula) и мучнистой росой дуба (возбудитель Microsphaera alphitoides) [12]. В тоже время для хвойных пород было выявлено значительное число заболеваний, характеризующихся сходной внешней симптоматикой, что делает визуальную диагностику затруднительной. При этом выявленные болезни различались по этиологии (вызываемым причинам), а также мерам профилактики и защиты. Видовой состав патогенов представлен в таблице. Графическое отображение данных о частоте встречаемости основных болезней посадочного материала хвойных видов в изученных питомниках приведено на рисунке 5.

Таблица – Выявленный видовой состав патогенов хвойных пород на основе молекулярно-генетической диагностики

Лесхоз

Порода

Вид патогена

Пинский

сосна

Phoma pomorum

Быховский

ель

 

сосна

Sphaeropsis sapinea, Phoma pomorum, Alternaria sp., Aureоbasidium pullulans

Sclerophoma pithya, Aureоbasidium pullulans

Речицкий

сосна

Phoma pomorum

Белыничи

сосна

Alternaria sp.

Ивьевский

лиственница

Meria laricis

Могилев

ель

туя

сосна

Cladosporium herbarum, Rhodotorula sp.

Epiccocum nigrum

Cladosporium sp.

Слонимский

туя

Cercospora kikuchii

Ветковский

сосна

Phoma macrostoma

Новогрудский

ель

пихта

Phoma pomorum

не имеющий таксономического описания вид гриба класса аскомицеты (идентифицирован впервые)

Смолевичский

сосна

ель

Cladosporium herbarum

Cladosporium herbarum, Cladosporium sp., Aureobasidium pullulans, Melampsora laricis

Волковысский

туя

Botrytis cinerea, Cladosporium herbarum, Sclerophoma pithya

Горецкий

ель

сосна

Rhizosphaera kalkhoffii

 Sistotrema sp. , Phoma herbarum

Кореневская ЭЛБ

сосна

Cladosporium herbarum, Alternaria alternata, Cryptococcus pinus, не имеющий таксономического описания вид гриба класса аскомицеты (NCBI GQ413953)

Двинская ЭЛБ

ель

 

сосна

Cladosporium sp., Sporobolomyces sp. Alternaria sp., Phoma sp., Epicoccum nigrum

Aureоbasidium pullulans, Epicoccum nigrum

Горецкий

ель

 Alternaria alternata

Милошевичский

cосна

Sphaeropsis sapinea, Phoma sp., Cladosporium sp.

Вилейский

(предоставлено ГУ «Беллесозащита»)

 

Rhizoctonia solani, Cladosporium sp., Cladosporium cladosporides, Aureobasidium pullulans

Калинковичский

сосна

Sydowia polyspora, Rhizoctonia solani, Phoma macrostoma

Светлогорский

сосна

Phoma sp., Alternaria alternata

Мозырский

сосна

Phoma macrostoma

Жлобинский

сосна

Cladosporium sp.

Октябрьский

сосна

Phoma sp., Alternaria sp., Cladosporium cladosporioides, Epicoccum nigrum, Fusarium sp., Fusarium sporotrichioides

Чаусский

ель

Cladosporium sp., Alternaria sp., Cladosporium cladosporides, Cladosporium herbarum

 
 
Рисунок 5 – Встречаемость болезней посадочного материала хвойных видов в изученных питомниках (на основании данных молекулярно-генетической диагностики)
 
Как видно из таблицы и рисунка 5 в наибольшем числе случаев представлены заболевания, вызываемые некротрофными грибами родов Phoma, Cladosporium, Alternaria и Epi-coccum. Внешнее проявление болезней, вызываемых данными грибами, сводится к пожелтению и усыханию хвои (шютте), что зачастую приводит ошибочной постановке диагноза, как обыкновенное шютте сосны (вызывается грибом Lophodermium pinastri) или ели (вызывается грибом Lirula macrospora) при непосредственной визуальной оценке. Ниже приводится описание выявленных патогенов и вызываемых ими заболеваний посадочного материала. 
Представители рода Phoma являются широко распространенными почвенными микромицетами, проявляющими патогенные свойства по отношению к широкому кругу сельскохозяйственных и лесных видов растений. В лесных питомниках Phoma spp. вызывает фомоз (сухую гниль) посадочного материала хвойных пород. Заражение растений данным патогеном происходит в основном в период переувлажненности почвы, через хвою, кон-тактирующую с землей. Затем патоген распространяется вдоль по стеблю и вызывает гибель верхушечной почки растения (рисунок 6). На начальном этапе развития болезни преимущественно поражаются только ослабленные сеянцы и саженцы, в случае массовой вспышки патогена, инфицированию подвергаются также и здоровый посадочный материал [13]. 
Для ограничения вредоносности патогена, по литературным данным, наиболее эффективным является регулярная (каждые 2 – 4 недели) обработка вегетирующих сеянцев комплексом фунгицидных препаратов содержащих хлороталонил, или его аналоги. Вследствие того, что виды Phoma являются возбудителем заболеваний многих пропашных культур (например, патоген кукурузы Ph. pomorum), не рекомендуется выращивание посадочного материала или создание лесных культур на данных типах сельскохозяйственных земель без проведения предварительного севооборота.
 
 
Рисунок 6 – Симптомы фомоза сеянцев сосны обыкновенной
 
Cladosporium spp. – анаморфные грибы, возбудители темно-оливковой плесени посадочного материала хвойных пород, также поражающие преимущественно ослабленные растения. Симптомами кладоспориоза является изначальное потемнение хвои, приобретающей на последующих этапах патогенеза оливковый оттенок и появление на поверхности тканей буровато-оливковый мицелия, рисунок 7. Спороношение, и, следовательно, зара-жение растений происходит в течение всего вегетационного периода при благоприятных для развития гриба условиях. Интенсивному распространению болезни способствует повышенная влажность воздуха, часто выпадающие осадки, резкая смена суточных температур [1].
Возникновение кладоспориоза, по данным различных авторов, в большинстве случаев обусловлено нарушением условий хранения посадочного материала и агротехники выращивания. Источником инфекции в лесных питомниках служат отмершие растительные остатки, на которых Cladosporium может существовать сапротрофно на протяжении длительного периода. Кроме того, возбудители кладоспориоза в незначительном количе-стве представлены в эпифитной микрофлоре здоровых растений.
На начальном этапе развития болезни, исходя из литературных материалов, эффективным является использование фунгицидов на основе 12-оксофитодиеновой кислоты (12-oxo-PDA), что позволяет в полной степени оздоровить посадочный материал [14]. В случае эпифитотий целесообразным является полное удаление пораженных сеянцев и отмерших растительных остатков. При этом следует производить уничтожение (сжигание) расти-тельного материала за пределами питомника.
 
 
Рисунок 7 – Внешние симптомы кладоспориоза сеянцев сосны обыкновенной
 
Грибы рода Alternaria являются возбудителями альтернариоза – сухой пятнистости хвои и листьев. Темно-коричневые или черные некротические пятна пораженных участков ткани могут появляться и на стебле. На поздних стадиях заболевания на пораженной хвое, которая становится бурой, и веточках появляется бархатистый налет мицелия черного цвета. Споры с пораженных участков тканей легко переносятся ветром на большое расстояние, и становятся новым источником инфекции. Как правило, больные растения распола-гаются очагами. Спорообразованию способствует частая смена сухой и влажной погоды [1]. 
Растения, ослабленные неблагоприятными погодными или почвенными условиями, более восприимчивы к альтернариозу. Факторами, как отмечается в ряде работ, способствующими развитию альтернариоза, являются нарушение агротехники выращивания, недостаток влаги в почве, низкое содержание азота и калия, избыточное количество фосфора, а также пораженность семенного материала вирусами, ризоктониозом и другими болезнями.
Наиболее действенный метод защиты от альтернариоза – химический. Защитные обработки против альтернариоза следует проводить после обнаружения первых симптомов заболевания. Высокую эффективность, по данным различных исследователей, показали фунгициды на основе дифолатана. В годы депрессивного развития альтернариоза доста-точным является 1 – 2 обработки фунгицидами, в годы умеренного проявления болезни — 2 – 3, в эпифитотийные — 3 – 4.
 
Рисунок 8 – Внешние симптомы альтернариоза саженцев ели европейской
 
 
Epicoccun nigrum – широко распространенный гриб отдела аскомикота, являющийся возбудителем заболеваний большого числа сельскохозяйственных культур и лесных видов растений. Отличительной особенностью Ep. nigrum является выработка видоспецифического пигмента, проявляющего фунгицидную активность по отношению к другим грибам. Симптомом поражения эпикокком является изменение окраски (побурение) хвои (рисунок 9) [1].
По литературным данным, возникновение эпикоккоза в большинстве случаев также обусловлено нарушением условий хранения посадочного материала и агротехники выра-щивания. Источником инфекции в лесных питомниках служат отмершие растительные остатки, на которых Ep. nigrum может существовать сапротрофно на протяжении длительного периода. Кроме того, данный патоген в незначительном количестве присутствует как эндофитный гриб у здоровых растений.
На начальном этапе развития болезни, по мнению ряда авторов, эффективным является 3-кратная обработка вегетирующих сеянцев системными фунгицидными препаратами, содержащими дифеноконазол, что позволяет остановить развитие патогенеза [16]. В случае эпифитотий также целесообразным является полное удаление пораженных сеянцев и отмерших растительных остатков.
 
 
Рисунок 9 – Симптомы поражения посадочного материала туи (биоты восточной) Ep. nigrum
 
Как видно из таблицы, в двух обследованных питомниках, был выявлен фитопатоген-ный гриб Sphaeropsis sapinea – возбудитель диплодиевого некроза (диплодиоза) хвойных. Данный патоген представляет большую потенциальную опасность для многих местных видов хвойных растений. Эпифитотии диплодиоза наносят огромный ущерб лесному хозяйству США, Канаде и ряду стран Европы [17]. Эпитофийное развитие диплодиоза сосны на всей территории Беларуси было впервые отмечено в 2009 году.
Sph. sapinea вызывает поражение и отмирание молодых побегов хвойных в лесных питомниках, лесных культурах и молодняках в возрасте до 25 – 30 лет. Внешними призна-ками заболевания посадочного материала диплодиозом является частичное или полное усыхание центрального и боковых побегов текущего года прироста, приводящее в дальнейшем к полному усыханию растения (рисунок 10).
 
 
 
Рисунок 10 – Внешние симптомы диплодиоза саженцев ели европейской
 
Кроме диплодиоза, в ряде лесхозов у интродуцентов были выявлены случаи инвазивных для Беларуси фитозаболеваний: мериоз лиственницы; склерофомоз туи; не имеющие микологического описания виды патогенных аскомицетов, выявленные у пихты и др. Дан-ный факт указывает на необходимость организации эффективного фитосанитарного контроля закупаемых семян и посадочного материала.
В целом, анализируя видовой спектр патогенных микромицетов, выявленных в поса-дочном материале хвойных видов, следует отметить, что наибольшее число выявляемых болезней лесных древесных пород являются неспецифическими, и связаны, в основном, с поражением ослабленных растений. В свою очередь первичным ослабление сеянцев и саженцев было вызвано длительным действием внешних неблагоприятных факторов. Среди них можно выделить как антропогенные: нарушение агротехники выращивания посадоч-ного материала, не соблюдение условий хранения, технологии предпосевной обработки и посева семян; абиотические: метеорологические (повреждение низкими и высокими тем-пературами, градом и др.), гидрологические (засуха, переувлажненность), эдафические (неблагоприятные почвенные условия); биотические (механические повреждения насеко-мыми, клещами-фитофагами и другими живыми организмами).
 
Заключение
Обобщая результаты молекулярно-фитопатологического анализа посадочного мате-риала в исследованных лесных питомниках можно сделать следующие выводы:
использование методов молекулярной генетики позволяет на качественно новом уровне проводить раннюю диагностику и идентификацию болезней посадочного ма-териала в лесных питомниках. Методы ДНК-анализа позволяют выявлять и иденти-фицировать фитопатогены как в посадочном материале, так и объектах окружающей среды (почва, растительные остатки и др.). Кроме того, существенными моментами ДНК-диагностики, в отличие от визуальной фитопатологической оценки, являются точная постановка диагноза, а также возможность выявления болезней на самых ран-них стадиях ее развития;
выявленные в ходе исследования питомников доминирующие фитозаболевания, по литературным данным, являются неспецифичными и связаны в основном с поражением ослабленных растений. Причинами ослабления посадочного материала могут выступать – нарушение агротехники выращивания или воздействие неблагоприятных метеорологических факторов;
в случае возникновения стрессовых для посадочного материала внешних условий, а также появления очагов болезни желательно применять широкий спектр фунгицидов, имеющих, по мнению ряда исследователей, неодинаковую эффективность по отно-шению различным видам патогенов;
особое внимание необходимо уделить фитосанитарному контролю закупаемых семян и посадочного материала интродуцентов, что связано с угрозой появления и распро-странения новых видов возбудителей болезней;
в случае культивирования посадочного материала интродуцентов, для предотвращения ослабления растений, необходимо в максимальной степени соблюдать соответствие климатических и эдафических условий их выращивания.
 
Список литературы
1. Лесная фитопатология: Учеб. для студентов специальности «Лесное хозяйство» / Н. И. Федоров. – Мн.: БГТУ, 2004. – 462 с.
2. Билай,  В.И. Микроорганизмы – возбудители болезней растений (справочник) / В.И. Билай [и др.]. – Киев: Наукова думка, 1988.  –  550 с.
3. Семенкова, И.Г. Фитопатология: Учебник для студ. Вузов / И.Г. Семенкова, Э.С. Соколова. – М.: Издательский центр «Академия», 2003. – 480 с.
4. Дьяков, Ю.Т. Общая и молекулярная фитопатология / Ю.Т. Дьяков. – М.: Общ-во фитопатологов, 2001. –  301 с.
5. Падутов, В.Е. Методы молекулярно-генетического анализа / В.Е. Падутов, О.Ю. Баранов, Е.В. Воропаев. – Мн.: Юнипол, 2007. – 176 с.
6. White, T.J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics / T.J. White [et al.] // in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, M. A., D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White eds.). – New York: Academic Press Inc. – 1990. – P. 315-322.
7. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/
8. Баранов, О.Ю. Молекулярно-генетическое маркирование патогенеза лесных дре-весных видов / О.Ю. Баранов, В.Е.Падутов, С.В. Пантелеев // Вес. Нац. акад. навук Беларусi. Сер. бiял. навук. Прилож. к журналу «Молодежь в науке – 2009». – 2010. – Ч. 4. – С. 10-12.
9. Development of PCR primers from internal transcribed spacer region 2 for detection of Phytophthora species infecting potatoes / P.W. Tooley [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 1997. – V. 63. – P. 1467–1475.
10. Баранов О.Ю., Ошако Т., Каган Д.И. Выявление и видовая идентификация пато-генных грибов с помощью ДНК-маркеров (на примере фитофторы) // Проблемы лесоведе-ния и лесоводства: Сб. науч. трудов ИЛ НАН Беларуси.—  Вып. 67.— Гомель: ИЛ НАН Беларуси, 2007.— С. 111–118.
11. Griffiths, R.I. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environ-ments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition /  R.I. Griffiths [et al.] // Appl. Environ. Microb., 2000. – V.66 – P. 5488-5491.
12. Гапиенко, О. С. Атлас болезней лесных пород Беларуси / О. С. Гапиенко [и др.]; Министерство лесного хозяйства Республики Беларусь. – Минск: Ред. журн. «Лесное и охотничье хозяйство», 2011. – 160 с.
13. http://www.forestpests.org/nursery/phomablight.html
14. Zhou, Y. Synthetic molecular mimics of naturally occurring cyclopentenones exhibit antifungal activity towards pathogenic fungi / Y. Zhou [et al.] // Microbiology, 2011. – 157. – P. 3435-3445.
15. http://pmep.cce.cornell.edu/profiles/fung-nemat/aceticacid-etridiazole/captafol/
16. http://www.agrocn.com
17. Peterson, G.W. Diplodia Blight of Pines / G.W. Peterson //Forest Insect & Disease Leaf-let. – 1981. – V. 161. – 6 p.

 

Корпоративный вход